应用案例
DEAE纯化BSA实验
- 分类：应用案例
- 发布时间：2020-02-24 00:00:00
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DEAE纯化BSA实验
一、实验器材
1、仪器
SCG蛋白层析系统，紫外检测器。
2、层析柱
层析柱类型：DEAE，1mL层析柱。
二、流动相配置
1、平衡液（A）：20mM Tris-HCl，pH8.5。（配置方法：称量1.21g Tris放置于烧杯中，加入500mL纯水，搅拌融化，使用pH计测量pH然后使用HCl调节pH到8.5）
2、洗脱液（B）：20mm Tris-HCl，1.0M NaCl，pH8.5。（量取A溶液500mL，加入29g NaCl）。
三、样品配置
1、10mg/mL样品配置10mL。称量1g的BSA到小烧杯中，再加入平衡液溶解。
四、实验过程
1、将1mL DEAE预装柱正确安装到SCG蛋白层析系统上。
2、用纯化水以1mL/min的流速清洗5-10CV。（层析柱的内径为7mm，床高25mm；使用的流速1mL/min，10min。）
3、用平衡液以1mL/min的流速平衡5-10CV，直至UV、pH、电导平稳。
4、将制备好的样品使用注射器打入定量环中，此时仪器处于Load模式。
5、用平衡液清洗5-10CV，直至基线平稳，无杂峰出现为止。
6、用100%洗脱液洗脱5CV。
五、清洗
建议每使用5-10次后进行一次清洗，具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。
1、用5CV 2M NaCl以50cm/h的流速冲洗（保证接触时间为1-2h）。
2、用5CV 1M NaOH以50cm/h的流速冲洗（保证接触时间为1-2h）。
3、用5CV 2M NaCl以50cm/h的流速冲洗（保证接触时间为1-2h）。
4、用5CV纯化水以50cm/h的流速冲洗，直至UV、电导平稳。
5、用5CV保存液以50cm/h的流速冲洗后保存。
备注：保存液为20%乙醇或0.1M NaOH。
六、实验结果
1、手动实验结果
2、使用仪器进行序列运行，3次
七、常见问题
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问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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纯化时目标物不与介质结合 或结合量较低 |
1.上样量过载 |
降低上样量 |
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2.上样速度过快 |
降低上样流速 |
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3.蛋白或脂类在介质中聚集 |
及时有效地清洗介质或更换新的介质 |
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4.目标物不带电或与介质带同样的电荷 |
筛选合适的结合缓冲液 |
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5.样本或平衡液中盐浓度和pH不正确 |
检查样品和平衡液中的电导和pH |
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6.选用了错误的缓冲液 |
参考缓冲液选择表 |
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7.样品中加入了不合适的去污剂 |
检查样品中是否有不合适的去污剂 |
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洗脱时没有收集到目标物 或只收集到少量目标物 |
1.目标物没有与介质结合或结合量较少 |
先确认目标物是否与介质结合 |
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2.洗脱条件不合适 |
洗脱液洗脱能力不够，加大盐浓度和调整洗脱液pH |
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3.洗脱时间不够 |
降低流速，延长洗脱液的保留时间 |
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4.洗脱体积过小 |
加大洗脱体积 |
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5.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀 |
检测目标物在洗脱液条件（盐浓度和pH）下的溶解度和稳定性。 |
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目标物纯度较低
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1.样品没有经过前处理 |
样品上柱前必须要经过离心或过滤 |
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2.样品粘度过高 |
用平衡液适当的稀释样品，降低粘度。 |
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3.洗杂不彻底 |
加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致 |
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4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀 |
及时有效地清洗介质 |
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5.洗脱条件不佳 |
优化洗脱条件 |
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6.目标物出现降解 |
检测目标物的稳定性 |
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7.柱料装填效果不佳 |
重新装填或购买 |
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8.分离柱顶部有较大储样体积 |
重新装柱或降低储样体积 |
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9.介质中有微生物生长 |
介质使用完后，请及时正确保存介质 |
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介质载量下降 |
1.上样速度过快 |
降低上样流速 |
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2.蛋白或脂类在介质中聚集，导致载量下降。 |
及时清洗介质 |
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3.使用次数过多，配基被氧化或脱落 |
及时清洗介质或更换新介质 |
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色谱峰上升缓慢 |
介质装填过紧 |
重新装柱 |
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色谱峰拖尾 |
介质装填太松 |
重新装柱 |
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柱床有裂缝或干涸 |
出现泄露或大体积气泡引入 |
检查管路是否有泄露或气泡，重新装柱 |
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液流较慢 |
1.蛋白或脂类聚集 |
及时清洗介质或滤膜 |
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2.蛋白沉淀在介质中 |
调整平衡液和洗脱液组分，以维持目标物的稳定性和介质的结合效率 |
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3.分离柱中微生物生长 |
所用试剂必须经过过滤和脱气； 样品上柱前必须离心或过滤 |
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