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DEAE纯化BSA实验

DEAE纯化BSA实验

  • 分类:应用案例
  • 发布时间:2020-02-24 00:00:00
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概要:使用SCG蛋白纯化层析仪器,以BSA作为样品,DEAE层析柱进行分离纯化。
概要:使用SCG蛋白纯化层析仪器,以BSA作为样品,DEAE层析柱进行分离纯化。
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DEAE纯化BSA实验

一、实验器材

 

 

1、仪器

    SCG蛋白层析系统,紫外检测器。

 

2、层析柱

 

 层析柱类型:DEAE,1mL层析柱。

 

 

二、流动相配置

 

 

1平衡液(A):20mM Tris-HClpH8.5。(配置方法:称量1.21g Tris放置于烧杯中,加入500mL纯水,搅拌融化,使用pH计测量pH然后使用HCl调节pH8.5)

 

2洗脱液(B):20mm Tris-HCl1.0M NaClpH8.5。(量取A溶液500mL,加入29g NaCl)。

 

 

三、样品配置

 

 

     1、10mg/mL样品配置10mL。称量1gBSA到小烧杯中,再加入平衡液溶解。

 

 

四、实验过程

 

 

1、将1mL DEAE预装柱正确安装到SCG蛋白层析系统上。

 

2、用纯化水以1mL/min的流速清洗5-10CV。(层析柱的内径为7mm,床高25mm;使用的流速1mL/min,10min。)

 

3、用平衡液以1mL/min的流速平衡5-10CV,直至UV、pH、电导平稳。

 

4、将制备好的样品使用注射器打入定量环中,此时仪器处于Load模式。

 

5、用平衡液清洗5-10CV,直至基线平稳,无杂峰出现为止。

 

6、用100%洗脱液洗脱5CV。

 

 

五、清洗

 

 

建议每使用5-10次后进行一次清洗,具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。

 

1、用5CV 2M NaCl50cm/h的流速冲洗(保证接触时间为1-2h)。

 

2、用5CV 1M NaOH50cm/h的流速冲洗(保证接触时间为1-2h)。

 

3、用5CV 2M NaCl50cm/h的流速冲洗(保证接触时间为1-2h)。

 

4、用5CV纯化水以50cm/h的流速冲洗,直至UV、电导平稳。

 

5、用5CV保存液以50cm/h的流速冲洗后保存。

 

备注:保存液为20%乙醇或0.1M NaOH

 

 

六、实验结果

 

 

1、手动实验结果

 

 

2、使用仪器进行序列运行,3

 

 

 

七、常见问题

 

 

问题

可能原因

解决方案

纯化时目标物不与介质结合

或结合量较低

1.上样量过载

降低上样量

2.上样速度过快

降低上样流速

3.蛋白或脂类在介质中聚集

及时有效地清洗介质或更换新的介质

4.目标物不带电或与介质带同样的电荷

筛选合适的结合缓冲液

5.样本或平衡液中盐浓度和pH不正确

检查样品和平衡液中的电导和pH

6.选用了错误的缓冲液

参考缓冲液选择表

7.样品中加入了不合适的去污剂

检查样品中是否有不合适的去污剂

洗脱时没有收集到目标物

或只收集到少量目标物

1.目标物没有与介质结合或结合量较少

先确认目标物是否与介质结合

2.洗脱条件不合适

洗脱液洗脱能力不够,加大盐浓度和调整洗脱液pH

3.洗脱时间不够

降低流速,延长洗脱液的保留时间

4.洗脱体积过小

加大洗脱体积

5.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀

检测目标物在洗脱液条件(盐浓度和pH)下的溶解度和稳定性。

目标物纯度较低

 

1.样品没有经过前处理

样品上柱前必须要经过离心或过滤

2.样品粘度过高

用平衡液适当的稀释样品,降低粘度。

3.洗杂不彻底

加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致

4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀

及时有效地清洗介质

5.洗脱条件不佳

优化洗脱条件

6.目标物出现降解

检测目标物的稳定性

7.柱料装填效果不佳

重新装填或购买

8.分离柱顶部有较大储样体积

重新装柱或降低储样体积

9.介质中有微生物生长

介质使用完后,请及时正确保存介质

介质载量下降

1.上样速度过快

降低上样流速

2.蛋白或脂类在介质中聚集,导致载量下降。

及时清洗介质

3.使用次数过多,配基被氧化或脱落

及时清洗介质或更换新介质

色谱峰上升缓慢

介质装填过紧

重新装柱

色谱峰拖尾

介质装填太松

重新装柱

柱床有裂缝或干涸

出现泄露或大体积气泡引入

检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱

液流较慢

1.蛋白或脂类聚集

及时清洗介质或滤膜

2.蛋白沉淀在介质中

调整平衡液和洗脱液组分,以维持目标物的稳定性和介质的结合效率

3.分离柱中微生物生长

所用试剂必须经过过滤和脱气;

样品上柱前必须离心或过滤

 

 

关键词: SCG蛋白纯化仪 蛋白纯化系统 蛋白纯化仪 蛋白纯化设备 BSA 蛋白层析仪 蛋白层析设备

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发布时间:2020-02-24 00:00:00

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